ONPG试验是什么？详解其检测原理、方法及临床应用价值

邻-硝基苯-β-D-半乳糖苷（o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）试验是一种广泛应用于微生物学领域的生化试验，主要用于检测细菌是否具有β-半乳糖苷酶活性，该试验通过观察底物ONPG在酶作用下的水解产物颜色变化，实现对细菌代谢能力的定性或定量分析，在肠杆菌科细菌鉴定、食品微生物检测及基因工程研究中具有重要价值。

ONPG试验的基本原理

β-半乳糖苷酶是细菌代谢乳糖的关键酶，能够催化乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，部分细菌（如大肠埃希菌）虽可发酵乳糖，但缺乏完整的乳糖通透酶，导致乳糖无法快速进入菌体，此时ONPG可作为替代底物——其分子结构模拟乳糖中的半乳糖苷键，但无需通透酶协助即可进入细菌细胞，在β-半乳糖苷酶作用下，ONPG水解为黄色的邻-硝基酚（o-Nitrophenol）和无色的半乳糖，邻-硝基酚在碱性条件下（如加入碳酸钠溶液）颜色稳定，最大吸收波长为420 nm，可通过肉眼观察颜色变化或分光光度计测定吸光度值，从而判断细菌是否具有β-半乳糖苷酶活性及酶活性强弱。

反应式简化如下：
ONPG + H₂O →（β-半乳糖苷酶）→ 邻-硝基酚（黄色）+ 半乳糖

ONPG试验的主要应用领域

肠杆菌科细菌的鉴定

肠杆菌科细菌中，β-半乳糖苷酶活性存在显著差异，是区分种间特征的重要指标。

• 阳性反应：大肠埃希菌（Escherichia coli）、克雷伯菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）等常见菌种通常呈阳性，因这些细菌能产生β-半乳糖苷酶，可快速分解ONPG产黄。
• 阴性反应：沙门菌属（Salmonella）、志贺菌属（Shigella）、变形杆菌属（Proteus）等呈阴性，因其缺乏该酶或酶活性极低。

该试验常与IMViC试验（吲哚试验、甲基红试验、VP试验、枸橼酸盐利用试验）联合使用，提高肠杆菌科细菌鉴定的准确性。

食品与水质微生物检测

在食品工业中，ONPG试验可用于快速检测乳制品、发酵食品中的污染菌，如大肠菌群（以β-半乳糖苷酶阳性为特征），水质检测中，通过ONPG试验判断水中是否存在粪便污染指示菌（如大肠埃希菌），为水质安全评估提供依据。

基因工程与分子生物学研究

在基因克隆中，β-半乳糖苷酶基因（lacZ）常作为报告基因，ONPG试验可用于检测重组菌中lacZ基因的表达情况，若插入片段导致lacZ基因失活，则菌落呈ONPG阴性（白色）；若lacZ基因完整表达，则菌落分解ONPG呈黄色（蓝白斑筛选原理的基础）。

常见细菌ONPG试验结果

ONPG试验的操作步骤与注意事项

试剂与材料准备

• ONPG试剂：称取ONPG 60 mg，溶于0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）100 mL，过滤除菌，4℃避光保存（有效期1个月）。
• 菌种：待检菌株18-24小时纯培养物。
• 其他：生理盐水、分光光度计、水浴箱、试管等。

操作步骤

（1）菌液制备：挑取待检菌落接种于3 mL生理盐水中，调整浊度至麦氏比浊管第3管（约1×10⁹ CFU/mL）。
（2）加样与孵育：取0.5 mL菌液加入试管中，加入0.5 mL ONPG试剂，混匀后置37℃水浴孵育，每隔15分钟观察结果，最长不超过24小时。
（3）结果观察：阳性反应管在孵育后逐渐出现黄色；阴性反应管始终无色，若需定量，可加入1 mL 1 mol/L碳酸钠终止反应，用分光光度计测定420 nm吸光度（OD值），OD值>0.1判为阳性。

注意事项

• 试剂保存：ONPG溶液对光敏感，需避光保存，若出现沉淀需重新配制。
• 菌液浓度：菌液过浓可能导致非特异性反应，过弱则影响结果观察，需严格控制浊度。
• 孵育时间：部分细菌（如缓慢发酵乳糖的菌株）可能延迟产酶，需延长孵育时间至24小时。
• 对照设置：每次试验需设置阳性对照（已知大肠埃希菌）和阴性对照（已知沙门菌），确保结果可靠性。

ONPG试验的结果判断与临床意义

结果判断

• 阳性（+）：菌液出现明显黄色，肉眼可观察；OD₄₂₀ nm ≥0.1。
• 阴性（-）：菌液无色，与阴性对照一致；OD₄₂₀ nm <0.1。
• 弱阳性（±）：菌液呈浅黄色，需延长孵育时间或结合其他试验确认。

临床意义

在临床微生物检验中，ONPG试验是肠杆菌科细菌鉴定的“关键试验”之一。

• 粪便标本中分离到的革兰阴性杆菌，若ONPG阳性、IMViC试验为“++--”，可初步判定为大肠埃希菌；若ONPG阴性、IMViC为“--++”，可能为产气肠杆菌。
• 在败血症、尿路感染等标本的病原学鉴定中，ONPG试验可快速缩小鉴定范围，指导临床合理使用抗菌药物。

ONPG试验结果与临床关联

相关问答FAQs

Q1：ONPG试验与乳糖发酵试验有何区别？
A：ONPG试验直接检测细菌的β-半乳糖苷酶活性，无需细菌完整代谢乳糖的能力，适用于缺乏乳糖通透酶的菌株（如部分迟缓发酵乳糖的大肠埃希菌）；乳糖发酵试验则观察细菌分解乳糖产酸产气的能力，需同时检测酸变（培养基pH下降）和气变（倒管内气泡），但受通透酶和酶活性双重影响，ONPG试验特异性更高，常作为乳糖发酵试验的补充验证。

Q2：ONPG试验出现假阳性的可能原因及如何避免？
A：假阳性多由以下因素导致：（1）ONPG试剂被污染或过期，导致非酶解产黄；（2）菌液浓度过高，细菌自身代谢产物显色；（3）孵育温度过高（>40℃）导致底物非酶解，避免方法包括：严格避光保存试剂并定期检查有效期；用生理盐水准确调整菌液浊度；控制孵育温度为37℃；设置阴阳性对照验证试验有效性。